大鼠小鼠常见证候计量化辨证方法的建立及其评价 |
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来源:飞鱼梦幻诛仙SF官网 日期:2011-10-09 05:40 |
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| 502中国中医基础医学杂志2007年第13卷第7期2007．01．13．．7实验研究大鼠、小鼠常见证候计量化辨证方法的建立及其评价。方肇勤，潘志强，卢文丽，刘小美，侯俐，廖明娟(上海中医药大学基础医学院，上海201203)材料与方法1．1四诊设备和方法1．1．1主要仪器设备200型电子天平用于动物和饲料称重，数字．01型温度计用于检测腋温，．体视显微镜用于显微爪、尾、舌的显微拍摄，颌定位器用于舌的显微拍摄，3200(色温)500摄像专用光源显微和普通照明，4500数码相机显微和普通拍照，底部划有6．5×5．5方格的实验笼用于旷场检测，一13型大、小鼠抓力测定仪用于抓力检测，个人电脑用于图像和数据处理。1．1．2四诊计量化所观察的指标体重，摄食量，饮水量，抓力，旷场水平跨格(跨格数)和垂直站立(前肢离地站立数)，腋温(℃)，爪、尾、舌显微拍照及图像处理，自然状态下心电图检测，以及疾病的特殊检测如肿瘤瘤径测量等。 1．2部分四诊数据的转换¨“1．2．1采用7．0图像软件，选取爪、尾、舌特定区域定量提取色度、，进而求出反映红色程度的值(=(++))。1．2．2电脑播放旷场录像，记录各动物水平跨格数，以及前肢离地站立次数。 1．2．3肿瘤估算体积(3)=0．5×瘤径长×瘤径宽2；并计算出去瘤体重=体重一估算瘤体积(假设肿瘤比重为1)。1．3所有四诊数据的处理1．3．1建立原始检测数据库不同日期的检测插入新表，形成完整的证候演变档案。每张表的“行”为不同组别、各动物及其编号，“列”为各检测内容及实测值和换算值，包括饮水量、摄食量、体重去瘤体重、抓力、水平、直立、腋温、心率、舌、爪、尾1-、瘤体积。1．3．2求出正常对照组各指标均数。1．3．3求出各组各动物实测值与正常对照组均数比值，用于分析。1．3．4求出各组比值均数，了解组别间总体差异。1．3．5汇总不同日期检测表中各动物、各组别以上数据，用以观察证候的发展和演变。1．4计量辨证处理及标准制定标准原则：鉴于不同批次动物和不同性别、月龄动物，以及不同疾病证候的特殊性传奇的，辨证标准要求依据各实验的实测值及其离散程度进行调整，调整后所确立的标准适用于该批次动物不同组别、不同时间检测与辨证，保证标准的一致。常见虚证大体标准如下。1．4．1气虚程度=各动物水平移动实测值正常组均数×0．3+各动物直立次数正常组均数×0．2+各动物抓力实测值正常组均数×0．5辨证标准：与正常组比较，大于1．25为气盛，小于0．75为气虚，小于0．5为气虚甚，小于0．25为气亏。1．4．2阳热程度=各动物腋温正常组均数×0．3+各动物爪正常组均数×0．5+各动物尾正常组均数×0．2辨证标准：与正常组比较，大于1．02为阳气盛，小于0．98阳虚，小于0．95阳虚重，小于0．9阳损。1．4．3阴虚程度=各动物体重正常组均值辨证标准：与正常组比较，大于1．2为形丰，小于0．85为阴虚，小于0．7为阴亏，小于0．6为液脱。1．4．4血虚程度=各动物爪正常组均数×0。6+各动物尾正常组均数×0。4；或各动物舌影正常组均数×0．5+各动物爪正常组均数×0．3+各动物尾正常组均数×0．2辨证标准：与正常组比较，大于1．1为血充盈，小于0．9为血虚，小于0．8为血虚重，小于0．7为血亏。1．4．5痰瘀邪盛=各动物瘤重，所有动物瘤重基金项目：上海市科委国际合作项目(064307052)；2006上海市教委学科建设项目；上海市卫生局项目(2004003)；上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金2007年第13卷第7期2007．01．3．．7中国中医基础医学杂志503均数大于1．5为邪毒甚，大于2为邪毒壅盛，小于0．75为邪较弱，0．5为邪弱。1．4．6糖尿病胃热程度=各动物饮水量正常组均数0．5+各动物摄食量正常组均数×0．5与正常组比较，大于1．5为胃热，大于2为胃热甚。1．5各组计量辨证值大小排序赋予单证候名，然后组合成复合证候名。单证候名如气盛、正常、气虚、气虚重、气亏；阳盛、正常、阳虚、阳虚重、阳损；形丰、正常、阴虚、阴亏、液脱；血充盈、正常、血虚、血虚重、血亏。复合证候名如气血图1正常小鼠阴液虚实分布图2正常小鼠元气虚实分布2．2某小鼠证候演变及其程度以下数据来自某批实验编号为82的荷瘤小鼠，以及在肿瘤接种后第7、14、20、28天的四诊检测(原始检测数据与正常对照组均数的比值)和辨证结果。如图5～8所示，该小鼠接种肿瘤的第7天，除直立次数减少外，大多与正常小鼠接近(正常组为1)；除肿瘤邪毒瘀证外，没有虚证表现。随着肿瘤增大，虚证逐渐发生并加重，大多四诊值逐渐下降；接种至第14天时出现气虚，至第20天时气虚发展到气虚甚，至第28天时出现气虚甚、阳虚与阴虚的兼证，阴阳两虚，程度重。该结果动态反映与记录了某疾病小鼠证候的形成与演变，形成了个体化疾病证候完整档案(还包括其他有关疾病、四诊原始数据)，为辨证论治方案的制定与疗效评价提供了客观化依据。2．3有是病便有是证及其证候的严重程度大多疾病伴有特殊的证候，实验动物也有类似图5某荷瘤小鼠抓力、水平移动和站立情况2．4同病异证两虚、阴阳两虚等。．6实验动物和方法依据有关文献5“，建立荷瘤小鼠、胃溃疡小鼠、糖尿病大鼠等模型。2结果2．1正常小鼠体质差异及气血阴阳盛衰程度以下数据来自120只正常小鼠的辨证，气血阴阳集中在正常范围，呈正态分布。在这120只小鼠中，辨证为气盛小鼠1只，气虚22只，气虚甚6只；阳气盛10只，阳虚5只，没有阴虚、血虚小鼠。 图3正常小鼠阳热虚实分布图4正常小鼠血液虚实分布的表现。 例如荷瘤小鼠的肿瘤，病机可以被归结为痰瘀热毒，具有痰瘀热毒证，该证候始终伴随着荷瘤小鼠。若不经治疗，大多肿瘤体积会不断增大，痰瘀热毒证逐渐加重。 通过瘤体积检测，可以动态观察痰瘀热毒证的演变。再如糖尿病，大多具有胃热、阴虚证候。图9、图10数据来自糖尿病大鼠。第1列为正常对照组(=9)，第2列为隐性糖尿病组(空腹血糖稍高于正常但小于11．1或2血糖稍高于正常但小于16．7，=5)，第3列为2型糖尿病组(空腹血糖>11．1或2血糖>16．7，凡=6)，第4列为1型糖尿病组(空腹血糖>16．7，凡=10)。 从图中可见，糖尿病有其特殊的证候一胃热与阴虚，随着疾病的加剧，程度加重。 这些表现与中医临床所见糖尿病患者多饮、多食、多尿的“消渴”证候类似，有是病，便有是证。图6某荷瘤小鼠去瘤体重演变情况图7某荷瘤小鼠腋温、爪、尾演变情况大鼠、小鼠同病异证的现象十分普遍，类姒于人类“病同而人异”。图11取自进入中晚期阶段的5个不同荷瘤小鼠，．32单纯气虚小鼠疾病的严重程度轻，仅表现为气虚；．36阳气盛小鼠表现为气盛，阴阳在正常水平，肿瘤小；．57邪毒甚阳气虚小鼠肿瘤大(痰瘀邪盛)，阳与气均低于正常水平；。82阴阳气虚小鼠，阴、阳、气均低于正常水平，存在复杂的兼证；．150单纯阳气虚小鼠大家，没有阴虚，肿瘤邪毒没有．57小鼠严重。同样接种肿瘤后的第28天，荷瘤小鼠证候及其严重程度存在如此大的区别，这就给504中国中医基础医学杂志2007年第13卷第7期2007．01．13．．7图8某荷瘤小鼠阴、阳、气证候演变情况图9糖尿病大鼠胃热表现及其程度胃热程度：个体饮水量正常组均数．5+个体摄食量，正常组均数0．5。辨证论治提出了要求。图12取自5个同期的1型糖尿病大鼠。．15大鼠阴阳两虚；．17大鼠出现气阴两虚，其中阴虚程度严重，阴亏；．25大鼠仅兼有阴虚证候，且气盛；．26大鼠，阴阳气亏损程度十分严重，气亏、阳损、阴竭，证候复杂；．29大鼠，阴阳气均虚，但程度却没有．26大鼠严重。同样的型糖尿病大鼠，不同虚证程度差异如此巨大，亦要求辨证论治。而证候的计量化辨证，提供了辨证论治的依据及评价指标。2．5异病同证不同疾病，甚至是正常动物与人类类似，可以出图1不同荷瘤小鼠同病异证情况图123讨论图10糖尿病大鼠阴虚证候特点胃热程度=个体饮水量正常组均数0．5+个体摄食量正常组均数0，5。现类似的证，证候的严重程度可以非常接近，且不论这些动物是否还存在其他兼证。图13是来自于两批不同实验的小鼠，将旷场活动作为评价气虚的依据。一批取自急性胃溃疡实验，．8正常对照小鼠是气阴两虚体质，．51消炎痛胃溃疡小鼠，出现了单纯的气虚。另一批来自荷瘤小鼠实验，．22为单纯阳虚小鼠(图中未列出阳虚程度)，．52为单纯气虚小鼠，．66为阴阳气虚小鼠(图中未列出阳虚程度)。这些小鼠虽然疾病不同，证候复杂性及其相兼不同，但均一致出现了气虚表现，而且程度十分接近。这给“异病同治”提供了依据。不同糖尿病大鼠同病异证情况图13不同疾病小鼠异病同证表现3．1所建立的计量化指标是否能够满足辨证需要3．1．1评价气盛衰的量化指标总体上，抓力与旷场检测均能客观反映大鼠、小鼠气的盛衰，可用以模拟人类的乏力、懒动、精力、肌力，准确地反映气虚程度。但由于动物兴奋状态以及对检测的耐受、适应、疲劳不同，会导致检测出现偏差；而连续多次的重复检测(如一些方法所建议的)，会增加动物的耐受，检测值会不断下降。 鉴此，最近我们把抓力引入气虚评价体系，与旷场各占50％的权重，这样可以弥补单独采用旷场或抓力带来的偏差，最大程度地贴近气虚的真实程度。此外，大鼠、小鼠的饮水量、摄食量、心率等也能在一定程度上反映气虚程度，可以较小权重引入。3．1．2评价阳热盛衰的量化指标我们把腋温、爪值(反映红色程度)、尾值作为常规阳气盛衰的量化指标，各自权重分别占30％、50％、20％，类似于人类的肤温高低、面色红润至苍白，可以代表性地反映阳热的盛衰。鉴于难以常规开展舌象检查以及在一些疾病模型中，比如晚期的肿瘤，心率检测难以开展，所以没有列入阳虚辨证的常规指标。 此外，同气虚检测一样，饮水量、摄食量也能在一定程度上反映阳虚程度，可以较小权重引入。 3．1．3评价阴液盛衰的量化指标阴虚主要表现为形质的减少，比如消瘦、脉细、舌体瘦小、苔剥等。热象的出现提示火旺，而当与气虚、阳虚兼见时，阴虚证的热象往往不显著。因此，我们主要采用体重(或去瘤体重)作为阴虚评价指标。 之前，我们曾采用爪中趾横径与掌面右侧上下两肉垫间距比值用于反映消瘦程度，该方法虽然比较精确，但换算费时，在大样本的动物实验中普及困难。 大鼠、小鼠望诊涉及形质减少的内容很多，如何进一步引入是今后的方向。 3．1．4评价血液盛衰的量化指标血虚主要包括两个方面，血液减少所导致的面色少华、舌淡，以及心神失养的心悸、少寐等。前者主要表现在望诊有关红色程度的改变。我们曾证明15。，在红色程2007年第13卷第7期2007．01．13．．7中国中医基础医学杂志505度反映方面，舌象最灵敏，爪次之，尾最弱。因此，血虚的主要指标应来自于反映红色程度的舌、爪、尾。鉴于阳虚也会出现面色少华、舌淡，所以血虚辨证的建立，还要求与阳虚鉴别。3．1．5评价病邪盛衰的量化指标对此，我们主要观察了肿瘤体积以及糖尿病饮食程度，重复性好。对于其他病邪，有待进一步观察。 总之，以上量化的四诊和辨证指标，符合中医学理论与实践，与中医临床实际相符，抓住了常见虚证的基本重要信息，是可以客观、动态、量化检测和评价证候的，也是可以满足大鼠、小鼠四诊和辨证要求的。3．2如何确定不同证候的辨证阈值理论上讲，正态分布的数据可以依据大样本统计获得不同证候的阈值，但鉴于大多实验所采用的动物样本小，难以符合大样本的数据特征，尤其是大鼠、小鼠批次不同、本游戏这一点真不错实验条件差异、月龄大小、性别不同等，都会导致具体某一批动物的正常参考值发生改变，使各证候评价阈值存在客观差异。因此，我们建议在正式实验前，对购入动物进行预检，依据预检结果参考以上标准，确定各证候辨证阈值。由于在同一批次内，动物证候具有相对的稳定性，因此该阈值对于该批动物内不同组别、不同时间检测的标准是一致的，因而是可以用于比较的。鉴于证候的程度是客观存在并可以检测的，因而可以直接用于疗效评价和证候发展与转归评价。3．3该方法操作的可行性这里主要指四诊检测与辨证的耗时，耗时多则难以开展大样本实验，检测的结果也不会稳定。而计量化辨证的最大困难之一是耗时：四诊检测、图像数据挖掘与处理、辨证等均要花时间。这也是为什么我们没有大量引入其他计量化检测技术的主要考虑之一，耗时多则没有可行性。 我们的目标是四诊与辨证能够在较短时间内完成，使该项技术适用于大样本的动物检测，具有可操作性。采用以上方法，我们最多一次实现同步检测170只小鼠，除旷场检测与分析在前1晚开展外(啮齿类动物晚上活动)，其余四诊和辨证均在内完成，参加成员4人，流水作业。可以实现当天辨证，当天晚上或次日用药。若样本小一些，例如在100例以内，则可以实现当天辨证，傍晚用药，因而此方法是可行的。 3．4计量化四诊与辨证方法的发展与完善证候是动物体内多因素的综合反映，例如心率快，可以因实、因虚或者虚实夹杂；证候与动物种属和品系有关，比如旷场，小鼠活跃，大鼠不活跃，57活跃，昆明鼠则相对安静；证候与动物月龄大小有关，如幼年好奇活跃，成年不活跃；不同疾病证候的表现还会具有特殊性，等等。 因此，需要开展大量的疾病．证候实验、不同品系和月龄大鼠、小鼠实验，逐一揭示这些证候的区别和特征，发展和完善辨证标准。此外，发展和优化四诊检测内容和技术，优化大鼠、小鼠的四诊工作站，细化和发展操作标准，以及适当引入传统的望诊、问诊(例如遗传、饲养、造模、治疗经过等)方法，以及本游戏这一点真行对爪、尾、舌等显微图像的数据挖掘等，都是今后需要努力的方向。3．5该方法对于病证研究的重要性学术界以往最大困难之一是如何开展病证结合的动物实验研究，中医临床、基础、诊断、中药药理药性、方剂等各学科均面临这样的困难。在大鼠、小鼠四诊和辨证方法建立之前，不少学者曾建议借鉴证候动物模型的方法，在疾病造模的基础上，叠加证候造模，但往往难以实施，一些尝试性研究还暴露出许多问题。同时，中医理论有关“有是病便有是证”的重要理论与实践也难以在动物实验中观察和应用。因而，本方法的建立能较好地模拟中医临床辨证，给辨证论治及病证结合研究创造了条件。总之，该方法初步实现了大鼠、小鼠标准化、计量化的四诊检测和辨证，可以动态跟踪证候的演变，评价辨证论治疗效，适用于中医基础、药理、诊断、临床等各中医药学科的研究使用。。 |
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